本文以 NirVivo-Pro NIR-II小动物活体荧光成像系统作为深层组织成像及血管相关变化动态监测的设备。血管靶向光动力治疗(V-PDT)是治疗血管相关疾病的一种有效手段，但是目前对深层血管在V-PDT过程中形貌及功能变化的实时、高分辨可视化监测依然是一个重大挑战。本文开发了一种基于吡咯并吡咯氮杂 - BODIPY 的近红外二区（NIR-II）荧光团 PTPE3 NP，用于血管靶向光动力治疗（V-PDT）中血管功能障碍的动态荧光成像，为评估 V-PDT 期间的血管反应提供了一种有效的方法。
PTPE3 NP 的合成与表征
· 合成与结构
以四苯乙烯（TPE）衍生物为电子给体（D）、吡咯并吡咯氮杂 - BODIPY（PPAB）为电子受体（A）合成了 PTPE1 - 3，通过 DFT 计算、吸收光谱和荧光光谱等手段对其进行表征，结果表明 PTPE3 具有较好的性能，其在 THF/H₂O 混合溶液中表现出聚集诱导发光（AIE）特性，在水相中的荧光量子产率（FLQY）为 0.94%，摩尔消光系数（MEC）为 2.64×10⁴ M⁻¹ cm⁻¹，荧光亮度为 248.16 M⁻¹ cm⁻¹。通过单晶 X 射线衍射分析，证实了 PTPE3 的结构特点。
图 1：PTPE 荧光团的合成与表征(a) PTPE1 至 3 的合成和分子结构。(b) 通过 DFT 理论计算的 HOMO、LUMO 和能隙Egap能级。(c) PPAB 和 PTPE1 至 3 在二氯甲烷中的归一化吸收光谱。(d) PTPE3 在不同水体积分数fw的 THF/H₂O 混合物中的 FL 光谱。(e) PTPE3 的 FL 强度与 THF/H₂O 混合物的fw。(f) PTPE3 的单晶分析和分子堆积。
· 纳米粒子制备与性能
PTPE3 与 Pluronic F127 组装形成纳米粒子（PTPE3 NP），其平均直径为 123 nm，水合粒径为 156 nm，Zeta 电位为 - 13.2 mV。PTPE3 NP 在 1000 nm 以上发射的荧光亮度为 180.05 M⁻¹ cm⁻¹，具有良好的光稳定性、pH 稳定性和活性氧 / 氮物种（RONS）稳定性，在 1% 脂质体模拟生物组织中，1300 nm 长通滤光片下成像深度可达 6.5 mm。
图 2：PTPE3 纳米颗粒的表征。(a) PTPE3 纳米颗粒的 DLS 结果和 TEM 图像。(b) PTPE3 纳米颗粒在水中的归一化吸收和 FL 光谱。(c) 在 808nm 激光激发下，PTPE3 纳米颗粒和 ICG 在水中的亮度比较（使用 1000 和 1300nm 长通滤光片）。(d) 在连续 808nm 辐射（1Wcm-2）下，PTPE3 纳米颗粒和 ICG（相同浓度，20pM）的光稳定性。(e) PTPE3 纳米颗粒在 0h、2h 和 24h 的 pH 稳定性。(f) PTPE3 纳米颗粒在各种活性氧和氮物种（RONS）处理后的 FL 强度变化。(g) 在不同深度的 1% 脂质溶液中，填充有 PTPE3 纳米颗粒的毛细管的 NIR-II 图像（使用 1000 和 1300nm 长通滤光片）。
PTPE3 NP 的体内成像应用
· 多尺度血管成像
PTPE3 NP 对正常细胞和肿瘤细胞的毒性较低，具有良好的生物相容性。通过尾静脉注射 PTPE3 NP 对小鼠进行全身和局部血管（后肢、肠系膜、肿瘤）成像，结果表明 1300 nm 长通滤光片下成像效果更好，可清晰观察到血管结构，分辨率较高，且能显示肿瘤血管的微观结构。
图 3：使用 PTPE3 纳米颗粒进行体内多尺度血管的 NIR-II FL 成像。(a) 静脉注射 PTPE3 纳米颗粒（150μL，2.5mgmL-1）后，使用不同长通滤光片的全身血管 NIR-II 图像。(b) 使用 1000 和 1300nm 长通滤光片的股血管图像的信噪比（SBR）。(c) 用不同深度的 1% 脂质溶液覆盖小鼠腹部后，使用 1000 和 1300nm 长通滤光片的股血管 NIR-II 图像。(d) 使用 1000nm 长通滤光片的后肢血管 NIR-II 图像。(e) 使用 1300nm 长通滤光片的后肢血管 NIR-II 图像。(f) 肠系膜微循环的 NIR-II 图像及通过 1300nm 长通滤光片的相应放大图像（白色虚线矩形）。(g) 沿图 3f 中白色虚线的横截面 NIR-II 荧光强度分布。(h) 肿瘤血管系统的 NIR-II 图像及通过 1300nm 长通滤光片的相应放大图像（白色虚线矩形）。(i) 沿图 3h 中白色虚线的横截面 NIR-II 荧光强度分布。
· 循环系统动态成像
尾静脉注射 PTPE3 NP 后，在 30 s 内对麻醉小鼠进行全身成像，可观察到 PTPE3 NP 在体内循环过程，其在心脏的荧光强度在注射后约 5 s 达到蕞大值，通过傅里叶变换分析证实荧光强度波动与心跳有关，心跳频率为 324 次 / 分钟。PTPE3 NP 的血液循环半衰期为 86.5 min，主要在肝脏和脾脏代谢。
图 4：循环系统的动态跟踪和 PTPE3 纳米颗粒的血液循环时间评估。(a) 注射 PTPE3 纳米颗粒后不同时间点的腹侧 NIR-II FL 图像（曝光时间 = 30ms）。(b) 注射后前 30 秒内心脏区域的 FL 强度随时间变化（插图：21 至 24 秒数据的放大视图，灰色线为 5.4Hz 的正弦振荡作为参考）。(c) 图 4b 插图中数据的傅里叶变换。(d) 注射 PTPE3 纳米颗粒和 ICG 后不同时间点采集的血液样本的 FL 强度。(e) 注射 PTPE3 纳米颗粒和 ICG 后不同时间点的 Balb/c 裸鼠体内 NIR-II FL 成像。
V-PDT 过程中的实时监测
· 肠系膜微循环反应监测
以肠系膜微循环为实验模型，使用血卟啉衍生物（HpD）作为光敏剂进行 V-PDT，通过 PTPE3 NP 实时监测血管反应。结果显示，随着激光剂量增加，血管出现收缩、血栓形成、血流中断等现象，可准确测量血流速度（BFV）变化，NIR-II 荧光成像能够清晰显示血管形态破坏、血栓形成和血流动力学异常过程，且比激光散斑衬比成像（LSCI）具有更高的分辨率和图像对比度。
图 5：实时监测血管靶向光动力治疗（V-PDT）期间肠系膜微循环反应。(a) 在 V-PDT 治疗期间，由 NIR-II FL 图像描绘的肠系膜微循环的功能和形态变化（1300nm 长通滤光片，808nm 激光）。(b) 在 V-PDT 治疗期间不同时间点的肠系膜血流（血管 1）的实时 NIR-II FL 图像（红色箭头所示为在毛细血管中跟踪的选定点，用于评估 V-PDT 治疗期间的血流动力学异常过程）。(c) 血管 1 在 V-PDT 下不同时间点的血流速度（BFV）变化。(d) 在未注射 HpD 的情况下，不同时间点获得的相对 BFV 变化（通过激光散斑对比成像（LSCI）获得）。(e) 通过 LSCI 获得的 V-PDT 期间肠系膜微循环的血流图像。(f) 通过 LSCI 获得的 V-PDT 期间不同时间点的相对 BFV 变化。
· 肿瘤血管破坏监测
建立 4T1 皮下移植瘤模型，注射 PTPE3 NP 和 HpD 后，使用 635 nm 激光激活 V-PDT，通过 NIR-II 荧光成像实时记录肿瘤血管反应。结果表明，肿瘤内出现明显出血，血管蕞终塌陷，而未注射 HpD 的对照组几乎无变化。LSCI 成像结果与 NIR-II 荧光成像一致，但 NIR-II 荧光成像在成像深度和分辨率上更具优势。此外，V-PDT 对肿瘤生长有明显抑制作用，且 PTPE3 NP 无明显副作用。
图 6：实时监测 V-PDT 下的肿瘤血管破坏。(a) V-PDT 治疗期间肿瘤血管破坏过程的示意图。(b) 注射 PTPE3 纳米颗粒（150μL，2.5mgmL-1）和 HpD（8mgkg-1）的 Balb/c 小鼠在 635nm 激光（100mWcm-2）下整个肿瘤血管的 NIR-II FL 图像。(c) 相应的放大肿瘤血管图像（白色矩形），肿瘤内可见不规则亮点（绿色箭头）表示明显出血。(d) 沿图 6c 中白色线条的肿瘤血管横截面强度分布（不同照射时间）。(e) 仅注射 PTPE3 纳米颗粒的 Balb/c 小鼠在 635nm 激光下整个肿瘤血管的 NIR-II FL 图像。(f) 相应的放大肿瘤血管图像（白色矩形）。(g) 沿图 6f 中白色线条的肿瘤血管横截面强度分布（不同照射时间）。(h) 使用 LSCI 观察 V-PDT 下肿瘤血管的图像。(i) 不同治疗后 4T1 荷瘤小鼠的相对肿瘤体积增长（n=5）。
