本文以 NirVivo-Pro  NIR-II小动物活体荧光成像系统作为靶向骨成像和改善类风湿性关节炎（RA）治疗的设备。无创精准的骨相关疾病诊疗手段需求迫切，但现有骨成像发光剂和 RA 治疗药物存在诸多问题，如成像分辨率低、药物体内清除困难及有全身并发症等。原子精确的 Au NCs 在生物医学领域应用广泛，基于 Au NCs 的 NIR-II PL 探针具有高时空分辨率和组织穿透深度，但将骨特异性 NIR-II PL 成像与增强的 RA 治疗功能相结合面临挑战。文章介绍了一种基于近红外 II 区（NIR-II）发射的 Au₄₄纳米团簇（NCs）磷酸化的诊疗探针，用于靶向骨成像和改善类风湿性关节炎（RA）治疗。

实验设计

· 制备 Au₄₄MBA₂₆ - P 探针

采用 “NaOH 介导的 NaBH₄还原” 法合成 NIR-II 发射的 Au₄₄MBA₂₆ NCs，通过简单交联策略将 3 - 氨基 - 丙烷 - 1 - 磷酸（APP）分子与表面配体 4 - 巯基苯甲酸（MBA）共轭，制备磷酸化的 Au₄₄MBA₂₆ - P 探针。

图 1(A)：Au₄₄MBA₂₆ - P 的示意图。注：磷酸基团用绿色圆圈标记，方案中仅显示部分配体。(B)：Au₄₄MBA₂₆和 Au₄₄MBA₂₆ - P 的紫外 - 可见（UV - vis）吸收光谱。(C)：Au₄₄MBA₂₆ NCs 的电喷雾电离质谱（ESI-MS）和同位素模式（ 黑色曲线：实验获得；红色曲线：理论模拟）。(D)：动态光散射（DLS）图谱，(E) 第二近红外窗口（NIR-II）光致发光（PL）发射光谱（激发波长 λ = 808nm；此处，NCs 浓度固定为 20μM），以及 (F) Au₄₄MBA₂₆和 Au₄₄MBA₂₆ - P 的傅里叶变换红外（FTIR）光谱。MBA：4 - 巯基苯甲酸；P：膦酸酯。

· 验证相关性能

对 Au₄₄MBA₂₆ NCs 和 Au₄₄MBA₂₆ - P 进行紫外 - 可见吸收光谱、电喷雾电离质谱（ESI-MS）、透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、NIR-II 光致发光（PL）光谱、傅里叶变换红外光谱、元素分析等表征；通过体外与羟基磷灰石（HA）的亲和力实验和体内 NIR-II PL 成像研究探针的骨靶向性能；以 RAW 264.7 细胞和 RA 大鼠模型进行体外细胞毒性、抗炎性能和体内治疗效果、作用机制研究，并评估其生物safety。

图 2(A)：羟基磷灰石（HA）在与 Au₄₄MBA₂₆（中间物品）和 Au₄₄MBA₂₆ - P（右边物品）反应前（左列）在可见光（上图）和近红外（NIR）光（下图）照射下的照片。(B)：HA 沉淀（1mg）与 Au₄₄MBA₂₆ - P 和 Au₄₄MBA₂₆（0.6mg/mL，0.2mL）反应后光致发光（PL）强度随时间的变化。(C)：HA 沉淀与不同浓度的 Au₄₄MBA₂₆ - P 和 Au₄₄MBA₂₆反应 2 小时后的 PL 强度变化。(D)：HA 上清液在与不同浓度的 Au₄₄MBA₂₆ - P 反应 2 小时前后的 PL 强度变化。(E)：HA 上清液在与 Au₄₄MBA₂₆和 Au₄₄MBA₂₆ - P 反应 2 小时后 PL 强度的下降比率。(F)：基于 (E) 中结果绘制的 HA 对 Au₄₄MBA₂₆ - P 和 Au₄₄MBA₂₆的朗缪尔吸附等温线。误差棒，平均值 ± 标准差（n = 3），*p < 0.05。MBA：4 - 巯基苯甲酸；P：膦酸酯。

实验结果

· Au₄₄MBA₂₆ - P 的特性

紫外 - 可见吸收光谱、ESI-MS、TEM 和 DLS 表明 Au₄₄MBA₂₆ NCs 成功合成，核心尺寸 1.54nm，HD 约 2.33nm，具有强 NIR-II PL（量子产率约 4.5%，发射峰在 1080 和 1280nm）。

磷酸化后，Au₄₄MBA₂₆ - P 的光学吸收、核心尺寸、HD 和 NIR-II PL 发射基本不变，傅里叶变换红外光谱证实 APP 与 NCs 成功共轭，元素分析显示每个 Au₄₄MBA₂₆ NC 表面约结合八个 APP 分子。

图 3(A)：Au₄₄MBA₂₆ - P 尾静脉注射（p.i.）后小鼠全身的时间进程第二近红外窗口（NIR-II）光致发光（PL）图像（曝光时间 100ms，1000nm 长通滤光片）。(B)：Au₄₄MBA₂₆和 Au₄₄MBA₂₆ - P 注射后软组织作为背景（SBR）的时间进程。Au₄₄MBA₂₆ - P 注射后 24 小时小鼠后爪（C）和侧卧位小鼠（D）的 NIR-II PL 图像。(E)：基于横截面强度分布对肋骨（D 中红色虚线）的半高全宽（FWHM）分析。误差棒，平均值 ± 标准差（n = 3），*p < 0.05。MBA：4 - 巯基苯甲酸；P：膦酸酯。

· 骨靶向性能

体外 HA 亲和力实验表明 Au₄₄MBA₂₆ - P 与 HA 结合能力强于 Au₄₄MBA₂₆，HA 与 NCs 混合溶液的 PL 强度变化证实其快速结合，通过 PL 强度测定和 Langmuir 吸附等温线计算得出 Au₄₄MBA₂₆ - P 对 HA 的蕞大吸附容量更高，密度泛函理论（DFT）模拟进一步证实其更强的结合能力。

体内成像显示 Au₄₄MBA₂₆ - P 注射后迅速在骨骼聚集，10 分钟即可检测到脊柱和膝盖摄取，12 小时可清晰识别多种骨骼结构，背景信号逐渐降低，骨与软组织信号比（SBR）高，24 小时后仍能实现高分辨率成像，且在主要器官中肾脏和肝脏 PL 信号较弱，表明其具有良好的肾清除率和生物safety。

图 4(A)：不同浓度的 Au₄₄MBA₂₆ - P 和 Au₄₄MBA₂₆处理脂多糖（LPS）诱导的 RAW 264.7 细胞中炎症细胞因子肿瘤坏死因子 - α（TNF - α）的浓度依赖性抑制。(B)：白细胞介素 - 6（IL - 6）。(C)：白细胞介素 - 1β（IL - 1β）。(D)：前列腺素 E2（PGE₂）。误差棒，平均值 ± 标准差（n = 3），*p < 0.05。MBA：4 - 巯基苯甲酸；P：膦酸酯。

· 治疗效果

RAW 264.7 细胞实验表明 Au₄₄MBA₂₆ - P 在 0.625 - 1mM 浓度下处理 24 - 48 小时无明显细胞毒性，不引起溶血，且能抑制脂多糖（LPS）诱导的炎症细胞因子分泌，包括肿瘤坏死因子 - α（TNF - α）、白细胞介素 - 6（IL - 6）、白细胞介素 - 1β（IL - 1β）和前列腺素 E2（PGE₂）。

在 RA 大鼠模型中，Au₄₄MBA₂₆ - P 和 Au₄₄MBA₂₆治疗效果与甲氨蝶呤（MTX）相似，可减轻关节肿胀、降低临床关节炎评分、增加体重，且对血液和生化参数无明显影响，主要器官无病理异常；组织病理学分析和微计算机断层扫描（micro - CT）成像显示 Au₄₄MBA₂₆ - P 能更好地恢复软骨与骨的界面，减轻炎症，消除骨侵蚀，改善关节畸形，优于 MTX。

图 5(A - C)：用生理盐水、甲氨蝶呤（MTX）、Au₄₄MBA₂₆和 Au₄₄MBA₂₆ - P 治疗 6 周期间，胶原蛋白免疫诱导的类风湿性关节炎（CIA）大鼠和未免疫正常大鼠（健康）的踝关节周长（A）、临床关节炎评分（B）和体重变化（C）的进展。误差棒，平均值 ± 标准差（n = 5）。(D)：在给药初始、中间和结束时间点，用生理盐水、MTX、Au₄₄MBA₂₆和 Au₄₄MBA₂₆ - P 治疗的 CIA 大鼠和健康大鼠的代表性照片。CIA 大鼠用生理盐水、MTX、Au₄₄MBA₂₆和 Au₄₄MBA₂₆ - P 治疗结束时血清（E - H）和关节组织（I - L）中肿瘤坏死因子 - α（TNF - α）、白细胞介素 - 1β（IL - 1β）、白细胞介素 - 6（IL - 6）和前列腺素 E2（PGE₂）的水平。误差棒，平均值 ± 标准差（n = 3），*p < 0.05。MBA：4 - 巯基苯甲酸；P：膦酸酯。

· 作用机制

免疫组织化学分析表明 Au₄₄MBA₂₆ - P 通过降低核转录因子 κB（NF - κB）信号通路中磷酸化 IκB、磷酸化 p65 和活化的 IκB 激酶（IKK）水平，抑制促炎细胞因子转录，从而发挥抗炎作用，且 Au₄₄MBA₂₆ - P 在降低这些指标方面效果优于 Au₄₄MBA₂₆。

图 6(A)：未免疫大鼠和 CIA 大鼠关节切片的代表性组织病理学图像。(B)：CIA 大鼠炎症、软骨和骨侵蚀的组织学评分。(C)：CIA 大鼠跖骨和踝关节的代表性微计算机断层扫描（micro - CT）图像。误差棒，平均值 ± 标准差（n = 3），*p < 0.05。MTX：甲氨蝶呤。

研究结论

Au₄₄MBA₂₆ - P 探针具有出色的骨靶向性能，可实现体内骨 NIR-II PL 成像，有效抑制 RA 大鼠的炎症反应，恢复骨组织，治疗效果优于 Au₄₄MBA₂₆和 MTX，且具有低细胞毒性、良好的肾清除率和生物相容性，有望用于骨疾病的临床治疗。

图 7(A)：免疫组织化学（IHC）检测磷酸化 IκB 激酶（IKK）、磷酸化 IκB 和磷酸化 p65 的代表性图像，以及关节组织中磷酸化 IκBα⁺（B）、磷酸化 p65⁺细胞（C）和磷酸化 IKK（D）的百分比。误差棒，平均值 ± 标准差（n = 3），*p < 0.05。MTX：甲氨蝶呤。