实验设计

·合成系列分子并制备纳米颗粒

以吡咯并吡咯氮杂 - BODIPY（PPAB）为电子受体合成具有 D - A - D 结构的 PT - Xs 系列分子，筛选出 PT - 3，将其修饰为两亲性分子 PTG，再与血管破坏剂 DMXAA 共组装成 PTDG 纳米颗粒，并制备不含 DMXAA 的 PTG 纳米颗粒。

图 1(a)：基于 PPAB 的分子（PT - Xs）的设计与合成。(b)：具有 D - A - D 结构的 NIR - II 分子（PT - 1 至 PT - 4）的化学结构。(c)：通过密度泛函理论（DFT）计算得到的 PT - Xs 的蕞高占据分子轨道（HOMO）、蕞低未占据分子轨道（LUMO）和能隙。(d)：PPAB 和 PT - Xs 在二氯甲烷中的归一化吸收光谱和 (e) 荧光光谱。

·表征和测试

对合成的分子和纳米颗粒进行核磁共振（NMR）、质谱（MS）、紫外 - 可见 - 近红外光谱、荧光光谱、透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、密度泛函理论（DFT）计算等表征；测试 PTDG 纳米颗粒的体外 DMXAA 释放、光物理性质、光热转换效率；通过细胞实验评估其体外抗血管治疗和光热治疗效果；利用 NIR-II 荧光成像技术进行体内全身血管成像、肿瘤血管破坏动态监测、长期肿瘤进展跟踪和体内联合治疗实验，并评估 PTG 纳米颗粒的长期生物safety。

实验结果

·PT - Xs 分子的合成与表征

成功合成 PT - 1 至 PT - 4 分子，其吸收和发射波长随给电子能力增强而红移，PT - 3 在 NIR-II 区域具有蕞高荧光量子产率（1.37%）和亮度（624.86 M⁻¹cm⁻¹），被选作进一步研究对象。

·PTDG 纳米颗粒的制备与表征

PT - 3 修饰后与 PEG 链反应得到 PTG，PTG 与 DMXAA 共组装成 PTDG 纳米颗粒，粒径约 96.0nm，在不同 pH 值下有形态和尺寸变化，酸性条件下可释放 DMXAA，在正常生理环境中稳定性良好。PTDG 纳米颗粒在水中的荧光量子产率为 0.54%（相对量子产率 0.27%），亮度为 119.61 M⁻¹cm⁻¹，NIR-II 成像能力优于吲哚菁绿（ICG），光热转换效率为 40.5%，且光热稳定性良好

图 2(a)：PTDG 纳米颗粒在不同 pH 值（7.4、7.0 和 6.5）的 PBS 中的透射电子显微镜（TEM）图像。(b)：动态光散射（DLS）分析。(c)：PTDG 纳米颗粒在不同 pH 值的 PBS 中 24 小时内 DMXAA 的释放曲线。(d)：PTDG 纳米颗粒的归一化吸收（空白线）和发射（红线）光谱。(e)：PTDG 纳米颗粒与 ICG 在水中使用 1000nm 和 1100nm 长通滤光片时的亮度比较。(f)：在 750nm 激光照射（0.7W/cm²）下，纯水和不同浓度 PTDG 纳米颗粒的温度变化。(g)：PTDG 纳米颗粒（100μg/mL）在 750nm 激光照射 15 分钟后的光热效应以及冷却时间与 - ln 的关系图和冷却期的线性拟合曲线。(h)：PTDG 纳米颗粒在 750nm 激光照射（0.7W/cm²）下五个加热 - 冷却循环的温度变化。

· 体外抗血管治疗和光热治疗效果

MTT 和染色实验表明 PTG 纳米颗粒生物相容性好，PTDG 纳米颗粒在黑暗中可有效杀伤血管内皮细胞，且在肿瘤酸性微环境下对血管的破坏作用更强，对 4T1 细胞也有显著的抗血管和光热联合治疗效果。

图 3(a)：通过 MTT 法测定不同浓度的 PTG 纳米颗粒和 PTDG 纳米颗粒在黑暗中孵育 24 小时后人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的相对存活率。(b)：通过 MTT 法测定 4T1 细胞在黑暗中或 750nm 激光照射（0.7W/cm²，10 分钟）下与 PTDG 纳米颗粒孵育后的相对存活率。(c)：用 50μg/mL 的 PTG 纳米颗粒和 PTDG 纳米颗粒在黑暗中孵育 HUVECs 后的钙黄绿素 AM / 碘化丙啶（PI）染色的荧光成像。(d)：用 50μg/mL 的 PTDG 纳米颗粒在黑暗中或 750nm 激光照射（0.7W/cm²）下孵育 4T1 细胞后的钙黄绿素 AM/PI 染色的荧光成像。

· 肿瘤血管破坏动态监测

4T1 荷瘤小鼠注射 PTG 或 PTDG 纳米颗粒后，肿瘤血管可清晰成像，PTDG 纳米颗粒注射后可实时监测肿瘤血管形态变化，10 分钟左右血管开始受损，35 分钟后严重破坏，而 PTG 纳米颗粒处理组无明显变化；激光散斑对比成像（LSCI）和免疫组化染色证实 PTDG 纳米颗粒可造成肿瘤血管严重损伤，归因于酸性肿瘤微环境下 DMXAA 的有效释放。

图 4(a)、(b)**：用 1000nm 和 1100nm 长通滤光片对尾静脉注射 PTG 纳米颗粒（150μL，2mg/mL）的 Balb/c 小鼠进行 NIR - II 全身血管成像以及放大的腹部和后肢血管（白色虚线框）图像。(c)、(d)**：使用 1000nm 长通滤光片时腹部和后肢血管沿白线的横截面 NIR - II 荧光强度分布。(e)、(f)**：使用 1100nm 长通滤光片时腹部和后肢血管沿白线的横截面 NIR - II 荧光强度分布。(g)：注射 PTG 纳米颗粒后不同时间用 1100nm 长通滤光片对 Balb/c 裸鼠进行 NIR - II 荧光成像。(h)：注射 PTG 纳米颗粒后不同时间血液样本的荧光强度随时间的变化。

· 长期肿瘤进展跟踪和体内联合治疗

PTDG 纳米颗粒在荷瘤小鼠体内主要分布于肝脏和脾脏，肿瘤部位也有较高积累，注射后 17 天仍可检测到荧光信号，可长期跟踪肿瘤进展，这得益于其在肿瘤微环境中酯键响应导致的聚集。体内联合抗血管 / 光热治疗实验表明，PTDG 纳米颗粒联合治疗组肿瘤生长得到完全抑制，组织学分析证实其抗肿瘤效果，且治疗过程中所有小鼠体重无异常变化，副作用可忽略不计。

图 5(a)：静脉注射 PTG 纳米颗粒后整个肿瘤血管的原位 NIR - II 荧光成像。(b)：图 (a) 中白色实线框内放大的血管图像。(c)：沿图 (b) 中白线的横截面 NIR - II 荧光强度分布以及使用 1100nm 长通滤光片的高斯拟合半高全宽（FWHM）。(d)：静脉注射 PTDG 纳米颗粒后整个肿瘤血管的原位 NIR - II 荧光成像。(e)：图 (d) 中白色实线框内放大的血管图像。(f)：沿图 (e) 中白线的横截面 NIR - II 荧光强度分布以及使用 1100nm 长通滤光片的高斯拟合 FWHM。(g)：分别注射 PTG 纳米颗粒和 PTDG 纳米颗粒后，通过对图 (a)、(d) 中白色虚线框内区域进行 NIR - II 荧光成像实时监测肿瘤血管形态演变。(h)：通过激光散斑对比成像（LSCI）记录注射 PBS、PTG 纳米颗粒和 PTDG 纳米颗粒前后肿瘤血管的相对血流速度变化。(i)：注射 PBS、PTG 纳米颗粒和 PTDG 纳米颗粒后用 CD31 对肿瘤血管进行免疫组化染色。比例尺：50μm。

研究结论

成功构建了基于 PT - 3 的 pH 响应性 NIR-II 纳米平台 PTDG 纳米颗粒，兼具高荧光亮度和良好光热效应，可实现肿瘤血管破坏过程实时监测、长期肿瘤进展跟踪和联合抗血管 / 光热治疗，为多功能响应性纳米平台构建和 NIR-II 荧光剂在体内生理过程动态监测中的应用提供了新方法。

图 6(a)：静脉注射 PTDG 纳米颗粒（150μL，2mg/mL）后 4T1 荷瘤小鼠在 24 小时内的 NIR - II 荧光成像。(b)：静脉注射 PTDG 纳米颗粒后不同时间点肿瘤的平均荧光强度。(c)：静脉注射 PTDG 纳米颗粒后 4T1 荷瘤小鼠在 17 天内的长期 NIR - II 荧光成像。(d)：不同治疗组小鼠的红外热图像和 (e) 肿瘤温度变化。(f)：不同治疗后 0 天和 14 天小鼠的照片。(g)：不同治疗后随时间变化的肿瘤生长曲线（n = 5）。(h)：不同治疗后肿瘤切片的苏木精 - 伊红（H&E）染色图像。(i)：不同治疗后 4T1 荷瘤小鼠在接下来 14 天内的体重变化（n = 5）。